在前两期的内容中，我们介绍了细胞转染与慢病毒转染的相关知识，本期将继续深入探讨慢病毒转染的实验操作、注意事项及常见问题。

一、慢病毒实验步骤

慢病毒实验流程主要包括以下几个步骤：质粒构建、病毒包装、病毒收集与浓缩、感染靶细胞、筛选与验证。

1. 质粒构建

构建重组质粒，将外源目的基因片段插入质粒载体，得到重组质粒后，将其转化入大肠杆菌，并提取重组质粒DNA。

2. 病毒包装

将重组质粒DNA及其他包装质粒按说明书比例共转染293T细胞，分别在48小时和72小时后收获含病毒的上清。

3. 病毒收集与浓缩

对收集到的病毒上清进行3000rpm离心20分钟过滤，然后用0.45μm滤膜去除细胞沉淀。继续以12000rpm离心进行初步浓缩，将浓缩液分装后在-80°C保存。同时，可进行病毒滴度的测定。超速离心法和PEG沉淀法都可用来浓缩病毒，其中超速离心对设备要求较高，而PEG沉淀法虽然简单、成本低，但效率稍逊。

4. 慢病毒转染细胞

第一天：以293T细胞为例，消化并收集状态良好的目标细胞，调节细胞密度至1×10⁵个/mL，接种到24孔板，每孔加入0.5mL，妥善混匀后放入37℃、5% CO₂培养。针对不同细胞，接种量根据生长速度会有所不同，通常在感染前确保细胞汇合度达到30%-50%。

第二天：加病毒转染。吸去旧培养基，添加预热的新鲜完全培养液，每孔0.25mL，继续在37℃、5% CO₂培养4小时。注意操作要轻柔，以免损伤细胞，并设立未加病毒的对照组。

第三天：全量换液。转染后24小时，如果细胞状态正常，吸去含病毒的培养液，补加新鲜完全培养液继续培养。

第四至六天：观察转染效果。若使用荧光标记的慢病毒，可以在转染后48小时通过荧光显微镜进行初步检测，并在适当浓度下添加puromycin或其他筛选药物，以筛选成功转染的细胞。对于生长缓慢的细胞，也可延长观察时间至96小时。

二、慢病毒实验注意事项

• 病毒保存：短期内可在4℃保存（不超过一周），长期需分装保存在-80℃冰箱，使用时及时融化，避免反复冻融影响病毒活性。
• 细胞状态：选择生长于对数期的细胞进行转染，以提高转染效率。
• 细胞接种量：根据细胞增殖速度与培养器皿大小调整。一般情况下，细胞铺板密度应为30%-50%。
• MOI值：合理的MOI值设置对提高转染效率至关重要，转染前需计算细胞接种量。
• 文献查询：实验前应查找相关文献，了解靶细胞的培养条件、生长速度等信息，从而优化转染条件。
• 细胞状态观察：在转染前后，需要密切关注细胞状态，必要时应调整细胞状态后再进行药物筛选。
• 观察时间：一般在转染后的48至72小时内观察转染效率，特殊情况下可延长至96小时以上。

三、实验常见问题

Q1: 如何提高慢病毒对细胞的感染效率?
保证细胞状态良好及适中的细胞密度是关键。对于悬浮细胞，采用离心感染的方法，使用病毒液进行感染，放置15分钟后再转入培养皿即可。

Q2: 转染后细胞死亡怎么办?
确保细胞状态良好是降低细胞死亡率的关键。可通过离心感染方法调整病毒剂量，改善转染效果。

Q3: 稳定转染与瞬时转染的区别是什么?
稳定转染将目的基因整合到染色体，并通过药物筛选获得稳定表达，而瞬时转染则无药物加压，阳性细胞在传代中逐渐减少。

Q4: 慢病毒转染时，细胞接种量应该是多少?
应根据细胞增殖速度及培养皿大小，确保感染后约4天内细胞均匀铺满培养皿底部。大多数细胞系在20%-30%汇合度时进行感染是理想的选择。

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